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同源重組構建質粒原理詳解

發布者:2022世界杯竞猜app下载技    發布時間:2021-11-09     
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分子生物學研究中質粒構建是最常用的實驗技術。原理依賴於限製性核酸內切酶,DNA 連接酶和其他修飾酶的作用,分別對目的基因和載體 DNA 進行適當切割和修飾後,將二者連接在一起,再導入宿主細胞,實現目的基因在宿主細胞內的正確表達。

同源重組的基因克隆方法, 相比雙酶切載體構建方法,該方法的構建過程有些不同,雙酶切構建過程比較繁瑣,同源重組構建過程相對簡單,可以省去很多的時間和精力,但假陽性率略高。


同源重組法構建載體

首先,靶基因片段擴增引物有別於常規引物設計;

其次,載體切割過程中隻需要進行單酶切;

第三,載體和目的基因片段的連接是基於同源重組而不是粘性末端互補。

 

采用同源重組法構建載體與常規雙酶切構建載體方法不同。

首先,設計引物時上遊引物5’端前麵加的是酶切位點(如Hind III)及該酶切位點在pMIR reporter載體中對應前麵的15個堿基載體片段,下遊引物5’端前麵加的是Hind III酶切位點及該酶切位點在pMIR reporter載體中對應後麵的15個堿基載體片段,如此設計引物是為了保證目的片段插入載體時方向正確。

其次,載體隻需要單酶切,用Hind III酶切pMIR reporter,使得pMIR reporter成為兩端都帶著Hind III位點的線性載體。相比雙酶切切割載體,單酶切可以保證酶切後的載體都是單一的線性片段,使得後續的重組連接更準確。

第三,省去了TA克隆環節。因為PCR產物可以直接用於重組連接,不需要酶切產生粘性末端,而且重組酶的重組能力強於T4 DNA連接酶的連接能力,一般隻需要一步即可重組連接成功,因此可以在重組反應之後進行測序鑒定。


詳解:

基於同源基因重組原理,適用於向幾乎任何載體在任何位點進行定向克隆,無需考慮插入片段自身攜帶的酶切位點可高效克隆 50 bp~10 kb 片段,同時構建時間也大大縮短。


1. 載體的製備一般推薦雙酶切線性化,線性化完全,假陽性克隆低。酶切體係同上。


2. 對於使用重組方式連接來說,PCR 要設計引物, 設計引物時要根據質粒載體和基因序列選擇合適的同源序列,通過 PCR 擴增方式進行連接,PCR 的產物要純化。


引物設計原則簡單總結一下:

(1)前向引物:5’ 端--上遊克隆載體末端同源序列+基因正向擴增引物--3’ 端

(2)反向引物:3’ 端--基因反向擴增引物+下遊克隆載體末端同源序列--5’ 端


如果設計的基因特異插入片段擴增產物長度較長,可以選擇 PCR 方式進行目的引物的擴增。


[可選 PCR 擴增體係]

ddH2O                       14 ul

10 x Taq buffer           2 ul

10 um DNTP              1 ul

10 um primer F          0.5 ul

10 um primer R          0.5 ul

Vector                        1 ul

Taq 酶                        1 ul


[可選 PCR 擴增條件]

(1)95℃:5min

(2) 35cycle

95℃:30s

55℃:30s(退火溫度可以根據目的引物TM值決定,一般退火溫度根 據引物TM值降低5度)

72℃:40s

(3)72℃:10min

(4)16℃:hold

PCR 擴增後,通過膠回收方式獲得純化的 PCR 產物。純化後的 PCR 產物不需要進行酶切,直接用於重組反應。


3. 目的引物與線性載體進行重組反應。


[可選重組體係]

5 × CE II Buffer           4 μl

線性化克隆載體          50~200 ng

插入片段擴增產物      20~200 ng

ExnaseII                  2 μl

ddH2O                        x ul


在冰水浴中配製,配製完成後,用移液器上下輕輕吹打幾次混勻各組分,置於 37 ℃ 反應 30 min。待反應完成後,立即將反應管置於冰水浴中冷卻 5 min。重組效率在反應 30 min 左右達到最高,反應時間不足或者太長都將會降低克隆效率,這樣大大減少了連接時間。


4. 轉化

將連接產物轉化到受體菌中(一般為 DH5a),塗板,培養過夜。


5. 挑取單克隆,並鑒定

挑去平板上的單克隆培養,可以通過 PCR 或者酶切初步鑒定陽性克隆,對初步鑒定出來的陽性克隆進行測序。


最後,幾個主要注意事項:

1. 載體克隆位點選擇盡量選擇無重複序列,且 GC 含量比較均勻的區域進行克隆。當克隆位點上下遊 20 bp 區域內 GC 含量均在 40%~60% 範圍之內時, 克隆效率將達到最大.

2. 最適克隆載體與插入片段摩爾比為 1:2,即最適插入片段使用量為 0.06 pmol。這些摩爾數對應的 DNA 質量可由以下公式粗略計算獲得:

最適克隆載體使用量 = [0.02 × 克隆載體堿基對數] ng(0.03 pmol)

最適插入片段使用量 = [0.04 × 插入片段堿基對數] ng(0.06 pmol)

3. 雙酶切 1 和 2,在設置酶切體係時要考慮酶切溫度以及 Activity in NEBbuffer 的問題。


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